介绍
在生物制剂的开发中，产生稳定的单克隆细胞系有着广泛的应用，如治疗性抗体，或为培养皿中的疾病模型创建CRISPR工程细胞。虽然对工程细胞系的需求有所增加，但单克隆细胞系的生产仍然受到当前单细胞分选和分配技术的限制。
本文，我们对比了传统技术的局限性与新技术（SCP4000, AURE.Inc）的特点，新技术拥有高达640个独立可控制的喷嘴，可以分析、分选和分配单个细胞到96孔或384孔板上，具有高效，高活力和高生长率。
此外，由于新技术在细胞分离的过程中对细胞几乎无损伤，除了永生化细胞系(例如CHO)，新技术还支持更敏感的细胞都可以在无菌环境下分离并培养成单克隆细胞系。
单细胞克隆技术现状
传统的方法，如激光捕获显微解剖(LCM)和微操作器集落挑选，可以分离单细胞，但是，它们的工作流程与活细胞不兼容，并且通量非常低。
使用传统的技术，比如有限稀释，是一种首选的解决方案，前期资源需求最小，对细胞的处理也很温和。
然而，有限稀释是低效的，不能积极选择产生蛋白质的细胞或避免死细胞，导致多余的下游成像工作。
流式细胞分选(FACS)方法允许以更高的通量分析和分选特定细胞。
然而，传统的基于液滴的细胞分选机制和流体系统将细胞暴露在巨大的剪切应力和大而快速的压力变化中，这些压力变化可能会杀死或损伤细胞，这减少了细胞菌落的生长。样品间的污染也是传统FACS的一个主要问题，因为流体管线不是一次性的，必须用化学方法清洗。
基于单流道的微流控技术的细胞分选方法改善了高剪切力对于细胞的损失，但是这类技术对单细胞液滴的控制要求很高，存在较大的液滴打偏概率，导致单细胞率低。
此外，由于单流道单喷嘴的设计，当出现细胞悬液粘稠，碎片比较多，或细胞黏连严重的情况，芯片会出现堵塞导致分选不成功。
SCP4000的优势
为了解决以上问题，新技术（SCP4000，AURE, Inc)中的核心部件—640个喷嘴集成到1个芯片中，解决了同类仪器因为细胞堵塞造成单细胞分选失败的问题，并且完全实现整个仪器的无管路式设计，样本间零交叉污染；(Pic 1)
Pic 1. 上海傲睿研发的SCP4000外观图以及高通量的生物芯片
基于高清成像及人工智能算法，可精准自动区分单细胞、悬液中碎片、多细胞。
此外还可根据单细胞的形貌，挑选优质的单细胞进行分选，从而提升单克隆形成率。(Pic 2)
Pic 2. 上海傲睿科技自主研发的AI细胞识别算法，
能够根据客户的需求筛选出优质的单细胞
芯片在送到客户之前，采用辐照灭菌，确保给细胞提供安全，无菌的环境。插拔式的安装设计，客户一步安装到位。(Pic 3)
Pic 3. SCP4000的生物芯片安装简易，一步到位。
结果
单克隆分选的准确性
为了测试SCP4000准确性，我们进行了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的分选，这是常用于生物制剂的生产细胞。
在分选之前，我们对于两个稳定的CHO细胞池进行红绿荧光染色，染色后混合均匀上样至芯片中进行单克隆分选。SCP4000将单个细胞分选到96孔板后（含有培养基）。
在经历2h后的细胞沉降，采用CELL METRIC（ADVANCED, Inc）细胞成像仪进行拍照，确认D0的单细胞孔。
然后在37°C, 5% CO2下孵育21天后，采用FACS分析每个单克隆团的荧光信号。
本次测试了共553个CHO细胞单克隆团，其中判定为绿荧光信号的孔数为265个，判定为红荧光信号的孔数为288个，判定同时有红绿荧光信号的孔数为0个。根据下图的公式，计算得到的单克隆保证绿为99.5%，满足FDA的要求。(Figure 1)
Figure 1. SCP4000分选的单克隆保证率
(a). 采用SCP4000分选得到的单克隆孔，培养21天后用FACS测量荧光信号。553个CHO细胞单克隆团，其中判定为绿荧光信号的孔数为265个，判定为红荧光信号的孔数为288个，判定同时有红绿荧光信号的孔数为0个。
(b). 根据计算公式，可以算出采用SCP4000得到的单克隆保证率为99.5%，满足FDA的要求。
单细胞分选效率及单克隆生长率
为了测试SCP4000分选的效率和克隆生长率，我们选取了转染分子后的项目CHO细胞，一共4个细胞池（pool ID分别为28,FB,FD,FE），采用SCP4000对每个细胞池分选5块96孔板。
并且，对于细胞池28，采用有限稀释法铺2块96孔板作为对照组。上样细胞的buffer为Sigma EX-CELL CHO。分选完成后，经过2h的细胞沉降，采用CELL METRIC(ADVANCED, Inc)孔板成像仪器进行拍照，确认D0的单细胞率。然后在37°C, 5% CO2下孵育18天，分别在D1，D2，D7，D18天确认细胞的分裂和生长状态。(Pic 4)
Pic 4. 采用SCP4000进行单克隆分选，
CELL METRIC进行单细胞孔板成像
对于单块96孔板的分选时长，SCP4000可以做到2min/96孔板分选。对于D0的单细胞接种率，我们对每个pool随机挑选了一块孔板进行统计，得到平均的单细胞率约90%(Figure 2)。
对于D18的单克隆生长情况，我们统计了包括有限稀释法在内的22块孔板的生长数据，其中SCP4000分选的10块孔板，单克隆获得率平均为77.63%，有限稀释法的2块孔板，单克隆获得率仅为11.58%(Figure 3)。并且，采用SCP4000分选得到的细胞团生长状态良好，汇合度高。(Pic 5)
Figure2. SCP4000单细胞分选效率与单细胞率
(a).不同pool的细胞，SCP4000分选每块孔板的平均时间in。
(b). 对于不同pool的细胞，随机选取一块孔板进行单细胞率统计。其中统计总数在96孔的基础上，减去了参考孔A1，以及边缘孔，幽灵孔。得到的平均单克隆约90%。
Figure 3. SCP4000单细胞分选的单克隆获得率
Figure 3. SCP4000单细胞分选的单克隆获得率：对于CHO项目细胞的2个细胞池，采用SCP4000分选得到的单克隆团数量平均值大于70个，单克隆获得率约77.63%，约为有限稀释法的6.6倍（以pool为例）
Pic 5. 采用SCP4000分选单克隆的孔板
在D18细胞的生长状态
结论
目前市场上的其他技术很难同时做到，高效并且温和的筛选出优质的单细胞到96或384孔板中，上海傲睿科技有限公司自研的SCP4000基于高达640可独立控制的喷嘴，配合AI识别单细胞算法，可以做到在2min分选1块96孔板，并且分选的过程柔和对细胞无剪切力，使得在D18客户可以达到77%的单克隆获得率，是有限稀释发的6.6倍，大大提高了细胞株开发的效率。
