关一民1 叶子璐2 杨苗苗1 姚淞淞1 刘震2 张浩然2 顾蕾2
1 上海傲睿科技有限公司
2 中国医学科学院苏州系统医学研究所
引言
单细胞蛋白质组学(Single-cell proteomics)主要是利用高分辨率质谱来分析单个细胞蛋白质组成的技术。然而，单细胞蛋白质组面临重要挑战是如何有效地高通量制备单细胞样本。单细胞蛋白质组样本快速制备的必要性体现在以下几个方面:
1. 提高数据准确性和一致性：单细胞样本的制备过程需要尽可能地避免细胞活性的损失和蛋白质的降解，单细胞样本的快速制备可以减缓这些问题的发生，从而提高数据的可靠性。
2. 减少样本之间的差异性：在单细胞层面上，任何操作上的细微差异都有可能引入单细胞间的显著差异。单细胞样本的快速制备可以显著降低操作导致的误差，保持样本状态的一致性。
3. 提高实验效率：单细胞样本的快速制备可以缩短实验的时间，提高通量。这对于大规模的单细胞研究尤为重要尤为重要。
4. 提高数据的可重复性：单细胞蛋白质组通常要求具有较高的重现性。快速制备可以确保不同实验之间样本处理的一致性，从而提高数据的可重复性。特别在纳升反应体系中，快速制备流程可以减少因工作液体蒸发造成单细胞样本之间的差异性。
5. 促进高通量研究：在大规模单细胞研究中，单细胞蛋白质组样本的快速制备是实现高通量分析的前提条件，使得能够在合理的时间内处理和分析大量数据。
因此，快速且高效的单细胞蛋白质组样本制备不仅能够提高数据的质量和实验的效率，还能推动单细胞蛋白质组学研究的发展。
本文利用单细胞蛋白质组学快速集成器（Single-cell Proteomics Rapid INTegrator, SPRINT ）进行单细胞蛋白质组样本的快速制备，以 HeLa 细胞或小鼠 MCA205 细胞作为测试样本。SPRINT 首先在 96/384 孔板中精准且快速打印裂解液，之后将单细胞分选到 96/384 孔板中，在仪器内进行孵育和酶切，最后利用 SPRINT 向 96/384 孔板中加入酸化缓冲液，完成单细胞样本的分选和样品前处理。利用 Vanquish Neo UHPLC 液相色谱结合 Orbitrap Astral 质谱仪进行 DIA 数据采集，采用 Spectronaut v19 进行数据分析。结果表明，采用 SPRINT 处理的单细胞样本，鉴定到单细胞的蛋白中位数为 5784（Library free search），并且在 8 小时内可完成 10000 个单细胞样本的准备。
SPRINT 的技术特点
SPRINT 的技术特点包含：
1. SPRINT 配备的 B150 是高通量打印芯片，相较于流式分选技术，B150 打印方式无需对液滴进行加电偏转，使得分选过程对细胞伤害较小，分选出的细胞活性较高。极大提升了单细胞分选效率，在96孔板中完成分选只需要 2 分钟，在 384 孔板中完成分选只需要 5 分钟。
2. SPRINT 配备的 B150 芯片最小可生成 30pL 的液滴，可以支持 pL-µL 级别的 buffer 分液；单细胞液滴也是 30pL ,可实现最大程度减少单细胞样本的体积，并降低细胞缓冲液对裂解和酶解体系的干扰。
3. 基于高清成像以及人工智能算法的 SPRINT 可以区分碎片、单细胞以及多细胞；支持 label-free 单细胞分选，可分选出活性较高的细胞；细胞活性越高，单细胞蛋白的鉴定结果越稳定。
4. SPRINT 可以输出细胞尺寸数值，支持蛋白质组数据和细胞尺寸的相关性分析。
5. SPRINT 仪器内部支持温度和湿度控制，腔室湿度可达 80%，孔板载台的温度可控制 4℃-90℃，在纳升移液和单细胞分选的过程中，可保证 nL 液滴在孔板中不挥发来确保 buffer 的稳定性。
6. 机器配有自动除静电装置和指定位置打印功能，可适配客户各类自研孔板或者基材，支持客户开发新的单细胞蛋白质组研究方法。
实验
推荐的仪器
SPRINT 单细胞分选仪器
推荐的试剂和耗材
B150打印芯片
MDA1墨水（红色）1mL
96/384尖底板
PBS（1X）10mL
生理盐水0.9%NaCl 10mL
胰酶消化液 10mL
DDM 10mg
1M TEAB 50µL
100ng/µL Trypsin 100µL
ddH2O 10mL
0.1% TFA 10mL
DMSO 100µL
细胞的收集
HeLa 细胞培养至汇合度约 50%-60%，去掉原有的培养基，利用 PBS 洗涤 1 遍，再加入适量的胰酶进行消化处理；然后加入等量的培养基终止消化，并轻轻吹打，利用 PBS 洗涤 2 遍；加入适量的生理盐水重悬细胞，使得溶液中的细胞浓度约为 1000 cells/µL，细胞置于 4℃ 冰箱短暂保存。
Buffer的制备
Master Mix buffer (0.2% DDM，100mM TEAB，20ng/µL Trypsin) ，用于细胞裂解，酶切反应：
1) 制备 1%DDM：称取 10.0mg，加入 990µL 脱气的 ddH2O，充分溶解，放 -20°C 备用
2) 制备 100ng/µL Trypsin：加入 200µL Trypsin Resuspension Buffer 到 20µg Trypsin，充分溶解，-20°C 保存备用
3) 配制500µL Master Mix：取1% DDM 100µL，1M TEAB 50µL，100ng/µL Trypsin 100µL，加入脱气的 ddH2O 250µL，混匀，-20°C 保存备用
4）酸化缓冲液（0.1%TFA/1% DMSO），用于酸化反应体系，10mL 0.1% TFA 加入 100µL DMSO，置于 4°C 保存备用。
单细胞样本的制备流程
1. 细胞收集
收集 HeLa 细胞：利用生理盐水重悬细胞浓度至 1000 cells/µL。
2. 仪器校准打印位置
采用 SPRINT 自带的下视镜头，将打印的单个液滴校准到 96/384 尖底板的底部中央。校准步骤包含了孔板安装的偏转角度以及仪器自带运动轴的定位精度。SPRINT 可以支持 200um 间距的单细胞点阵打印。图 1a 和图 1b 分别为下视对准尖底板的位置和在载玻片上的单细胞点阵。
图1a：下视镜头的中央对准尖底板底部（左）
图1b：200um间距的细胞点阵（右）
3. 裂解液铺板
在裂解液铺板之前，SPRINT 会对孔板进行全自动化的除静电操作。
SPRINT 利用 B150 芯片向 384 孔板中加入一定量的master mix buffer，SPRINT 支持100nl/300nl/500nl/1000nl体系，如图 2 所示，可精准地将不同体积裂解液打印到孔板底部。
图2：分别为100nl裂解液 300nl裂解液 500nl裂解液 1µL裂解液
针对384孔板，B150 芯片可以同时打印 3 个孔，每个孔使用 15 个喷嘴。高通量的喷嘴设计可以提高打印速度。测试打印不同体系裂解液的时间如表 1 所示：
表1测试打印不同体系裂解液所用的时间
本次实验采用300nl裂解液体系。
4. 单细胞铺板
SPRINT 打印芯片是基于 CMOS-MEMS 半导体技术加工的高通量喷嘴的细胞打印芯片，芯片每个喷嘴都有独立控制开关，如图 3 所示，当细胞落到喷嘴时，SPRINT 配备高清成像以及人工智能算法，可精准自动区分悬液中碎片、单细胞以及多细胞（如图 4 所示），一次可以识别几十个单细胞，一般细胞分选仪器一次只识别 1 个细胞。 B150 的高通量设计可以大大提高单细胞的分选效率。
图3：高通量喷嘴中的单细胞
在单细胞铺板的过程中，为了防止裂解液蒸发，需要控制机器内部腔室的湿度和孔板载台的温度。腔室内的湿度控制可高达 80%，载台的温度最低可到 4℃。
图4：单细胞识别算法
将 HeLa 细胞悬浮液上样至芯片内部，开始分选 10000 个单细胞，分选时长 4 个小时，在分选的过程中需要确保环境湿度达到 70%，孔板载台的温度低至 4℃，以防止裂解液的挥发。
5. 酶切反应
设置 SPRINT 孔板载台的温度为 50°C，湿度 85%，恒温恒湿下，进行酶切反应 2h，反应结束后，孔板载台温度冷却至 20°C。
6. 酸化缓冲液铺板
酶切反应结束后，将酸化缓冲液精确加到孔板中，每孔打印 1µL。打印的方式和所需时间参考表 1。
7. 封板和质谱分析
孔板封板后进行后续的液相分离和质谱分析。
结果与讨论
使用标准的 96 孔板制备了 0，1，10，20cells 的样品，其中单细胞样品的蛋白鉴定数为 4503~6039，中位数为 5784；10cells 的蛋白鉴定数为 6879~6885，中位数为 6880；20cells 的蛋白鉴定数为 6904~6932，中位数为 6917，如图 5 所示。
图5.单细胞蛋白质组的蛋白和肽段鉴定数（小鼠MCA205）
综上所述，本文展示了一套单细胞蛋白组分析的完整工作流程，考察了 300nl 裂解液以及 1µL 的酸化缓冲液体系，并取得了良好的实验结果。
傲睿科技的单细胞打印机，在单细胞组学的应用中可以大大提高纳升移液及单细胞打印的性能，可在 8 小时内完成 10000 个单细胞蛋白质组样本的处理，不但使研究人员能够在合理的时间内处理和分析大量数据，而且自动化、快速的处理流程还最大程度确保了样本的稳定性以及数据的可靠性。SPRINT 单细胞打印可以帮助科研用户推动单细胞蛋白质组 87 学研究的发展。
