在类器官培养领域，如何突破细胞增殖分化效率的瓶颈、优化染色检测的技术流程，始终是科研工作者攻关的重要方向。傲睿科技BP4000细胞球构建平台凭借前沿技术创新，在人结直肠癌类器官培养中开辟了新路径，其技术价值已通过大量实践得到验证。
以下是基于BP4000平台的最新人结直肠癌类器官构建实践案例：
一、人结直肠癌类器官的构建
1. 收集人肿瘤组织块，放在 50 mL离心管中，每管含有45 mL冰预冷的adDMEM/F12（含100 U/mL penicillin-streptomycin，10 mM HEPES，1×GlutaMAX）。adDMEM/F12培养基中建议加入10 μM ROCK抑制剂（Y-27632），以提高细胞存活能力。将组织样本保存在这种培养基中，置于4 °C，直至开始分离。
2. 在解剖显微镜下用手术剪刀或手术刀和镊子尽可能去除非上皮成分。
3. 在10 cm的细胞培养皿中，使用手术剪刀或手术刀将组织切成1-3 mm3的小块，并转移至15 mL离心管。
4. 按表1配置组织消化液，现用现配，37 ℃预热。将组织消化液加入到含有组织碎块的离心管中，放在37 ℃摇床上孵育。
表1：结直肠消化液配方示例
5. 当混合物变得浑浊且剩余的组织碎片被破碎时，使用移液器上下吹打10-20 次，进一步促进组织破碎。从顶部加入10 mL adDMEM/F12培养基（含100 U/mL penicillin-streptomycin，10 mM HEPES，1×GlutaMAX），并在 4 ℃下以200 g离心5分钟，对细胞进行清洗。
6. 将沉淀重悬在10 mL adDMEM/F12培养基中（含100 U/mL penicillin-streptomycin，10 mM HEPES，1×GlutaMAX），并用70-100 μm细胞滤网进行过滤。
7. 对重悬和过滤后的细胞进行离心，在4°C下以200 g离心5分钟。吸出上清液，将沉淀重悬在含70%基质胶（Corning #356231）的类器官完全培养基中。用移液枪滴在24孔板底部，每孔50 μL。
8. 将接种好类器官的24孔板置于37°C培养箱内，孵育10分钟，使基质胶凝固。
9. 向每孔中小心加入500 μL类器官完全培养基，将24孔板置于37℃、5% CO2加湿培养箱内培养。
10. 每2-3天更换一次培养基，从各孔中小心吸出培养基，然后加入新鲜的预热培养基。培养5-7天即可长出结直肠癌类器官。
二、打印前的准备
1. 按表1推荐的量在需要打印的孔板中预铺70%的铺基质胶（adDMEM/F12稀释），并在周围的空白孔中添加无菌水以保证整块板子的湿度。37℃培养箱中孵育45-60分钟，使基质胶凝固。提前半小时将加湿器打开，使超净台中的湿度维持在70-80%。
表1：不同孔板中铺基质胶的量
2. 提前半小时将加湿器打开，使超净台中的湿度维持在70-80%。
三、人结直肠癌类器官细胞悬浮液的配制
1. 24孔板中培养好的人结直肠癌类器官，小心地吸去孔中的培养基，不要破坏Matrigel dome。每孔加入400 μL TrypLE Express，室温（15 – 25℃）孵育1分钟。
2. 使用TrypLE Express预先湿润1 mL的枪头，上下吹打20次，吹散凝固的dome。
3. 37℃培养箱中孵育5-10分钟。
4. 使用TrypLE Express预先湿润1 mL的枪头，将培养物转移到15 mL的离心管中。
5. 以290×g，2 – 8℃下离心5分钟，小心去除上清液。
6. 加入10 mL（2 – 8°C）冷的adDMEM/F12重悬细胞，再以200×g，2 – 8℃离心5分钟，小心吸出上清的adDMEM/F12，不要接触到细胞沉淀。
7.重新添加第2步中等体积的TrypLE Express，将细胞沉淀重悬，37℃培养箱中孵育5-10分钟，至大部分类器官成为单细胞悬液。
8. 以290×g，2 – 8℃下离心5分钟，小心去除上清液。
9. 加入10 mL（2 – 8°C）冷的adDMEM/F12重悬细胞，再以200×g，2 – 8℃离心5分钟，小心吸出上清的adDMEM/F12，不要接触到细胞沉淀。
10. 用adDMEM/F12重悬细胞，将细胞密度调整为1×106个/mL。
四、打印接种人结直肠癌类器官
1. 打开打印机电源, 点击设备归零键。
2. 安装打印头，按照操作手册进行打印头Priming。
3. 将第二步中预铺基质胶的孔板（本示例为96孔板）放置在打印机孔板支架上。
4. 使用移液器吸掉打印头样品槽中的无菌PBS，吸取30 μL细胞悬液，缓慢加入到打印头的样品槽中，进行类器官打印，每孔打印2个循环（约500个细胞）。对照组，采用传统胶滴法，每孔5 μL胶滴（约500个细胞）。
5. 将打印好类器官的孔板放入37℃培养箱中孵育1小时。
6. 向孔板中缓慢滴加类器官完全培养基，放入37℃培养箱中培养。培养结果如图1所示。
图1：人结直肠癌类器官打印培养结果
图中标尺为500 μm
五、类器官的免疫荧光染色
该法适合通过打印方式接种后培养的类器官。
1. 从孔中移除培养基，缓慢加入200 μL不含钙镁的PBS清洗，重复2次，避免破坏类器官结构。
2. 吸去孔中的PBS，加入200 μL 4%PFA（多聚甲醛），4℃孵育45分钟。
3. 吸去孔中的PFA，缓慢加入200 μL不含钙镁的PBS清洗，重复3次。
4. 吸去孔中的PBS，加入200 μL OWB（配置方法：1 mL Triton X-100，2 g BSA，用PBS定容至1 L），4℃封闭30分钟。
5. 吸去孔中的OWB，加入100 μL 含有一抗的OWB，4℃过夜孵育。
6. 第二天，吸去孔中含一抗的OWB，加入200 μL OWB清洗，重复3次。
7. 吸去孔中的OWB，加入100 μL 含有二抗的OWB，室温避光孵育1.5小时。
8. 吸去孔中含二抗的OWB，加入200 μL OWB清洗，重复3次。
9. 吸去孔中的OWB，加入含1×DAPI浓度的OWB，室温避光孵育15分钟。
10. 吸去孔中含DAPI的OWB，加入200 μL OWB清洗，重复2次。
11. 显微镜拍照，图2是用PE公司的高内涵拍摄的人结直肠癌类器官Ki67染色结果。
图2：打印接种的人结直肠癌类器官
培养14天时的Ki67染色结果
标尺为200 μm
图3: 人结直肠癌类器官 绿色:Ki67,红色: F-actin,蓝色: 细胞核
图（A）打印后直接固定染色
利用打印方式构建类器官整体形态保存完整，染色背景清晰，操作更简单
图（B）胶滴法消化matrigel后固定染色
在消化matrigel的过程中容易发生类器官丢失或碎裂情况
BP4000 平台产品概述
3D细胞球构建平台 BP4000
为傲睿科技自主研发的细胞球构建自动化平台，BP4000 通过整合液滴控制与精准打印技术，为类器官培养提供了标准化解决方案。 该平台以 “聚集打印 + 免消化检测” 为核心设计理念，可在基质胶（Matrigel）等 ECM 表面完成单细胞或细胞群落的定量接种，通过自动化程序构建粒径均一、空间分布可控的三维细胞阵列。从技术实现来看，其核心模块包括高精度液滴生成系统、智能温控培养单元及兼容多规格孔板的机械臂平台，能够满足从基础研究到高通量药物筛选的全流程需求。
在类器官培养领域，BP4000的技术创新主要体现在两大核心优势 —— 一方面通过聚集打印模式突破传统培养中细胞增殖效率的瓶颈，另一方面以免消化染色技术重构检测流程，这些突破正通过人结直肠癌类器官等实践案例得到充分验证。
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优势一：突破细胞增殖分化效率的瓶颈
传统类器官培养中，细胞分布不均、局部密度不足是制约增殖分化效率的关键因素。
BP4000采用先进的聚集打印模式，通过精准的液滴控制技术，将细胞以优化的局部密度接种于基质胶表面，形成标准化细胞阵列。在人结直肠癌类器官培养实验中，BP4000每孔打印2个循环（约500个细胞）的聚集模式，与传统胶滴法相比，显著提升了细胞的空间聚集度。
这种高密度聚集打印带来了惊人的生长效率提升。实验数据显示，使用BP4000培养的结直肠癌类器官，其增殖分化速度较传统方法大幅提高。从培养结果图1可以清晰看到，打印组类器官在培养5-7天即可形成成熟结构，而传统胶滴法培养的类器官不仅生长周期更长，且结构完整性和一致性也明显逊色。
聚集打印形成的细胞微环境，有效促进了细胞间的信号传导与物质交换，为类器官的快速生长和功能分化提供了理想条件，这种高效的培养模式为后续的药物筛选和机制研究赢得了宝贵时间。
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优势二：优化染色检测
在类器官研究中，免疫荧光染色是分析细胞功能和分子表达的重要手段。传统胶滴法培养的类器官在染色时，需要先溶解Matrigel基质胶，这一过程常常导致类器官丢失或损伤，严重影响检测结果的准确性和可靠性。BP4000技术彻底革新了这一流程，其打印的类器官可直接进行免疫荧光染色，无需溶解Matrigel。这一创新带来了多重优势。
首先，避免了Matrigel溶解过程对类器官结构的破坏，从图2和图3可以直观看到，打印组类器官整体形态保存完整，而胶滴法在消化Matrigel后容易发生类器官丢失或碎裂。
其次，直接染色操作更简单，减少了实验步骤和时间成本。更重要的是，这种方法获得的染色信号更强、背景更清晰，如图2所示，打印接种的人结直肠癌类器官培养14天时的Ki67染色结果，细胞核、Ki67和F-actin的标记清晰分明，为精确的定量分析提供了优质样本。
BP4000的免消化染色技术，不仅提高了实验效率，更确保了检测结果的真实性和可靠性，为类器官功能研究开辟了新路径。
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BP4000：让类器官研究更加高效精准
从聚集打印提升增殖分化效率，到免消化染色优化检测流程，BP4000细胞球构建平台在人结直肠癌类器官培养中展现出的技术优势，不仅解决了传统方法的痛点，更推动了类器官研究向高效化、精准化方向发展。
其标准化、自动化的操作模式，为大规模类器官库的构建和高通量药物筛选提供了有力支撑，在肿瘤精准医疗、新药研发等领域具有广阔的应用前景。随着技术的不断创新和完善，BP4000有望在更多类型类器官的培养和研究中发挥重要作用，为生命科学和医学研究带来更多突破。
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